分享一下關(guān)于質(zhì)粒的分離操作方法

　　今天跟大家分享一下關(guān)于質(zhì)粒的分離操作方法，下面讓我們一起來了解一下吧。
 

　　從細(xì)菌中分離質(zhì)粒 DNA 的具體操作
 

　　材料設(shè)備試劑
 

　　一、材料
 

　　含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管)，離心管架。
 

　　二、設(shè)備
 

　　微量取液器(20μl，200μl，1000μl)，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。
 

　　三、試劑
 

　　1、LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani):稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。
 

　　2、LB固體培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。
 

　　3、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)母液:配成50mg/ml水溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 

　　4、溶菌酶溶液:用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。
 

　　5、3mol/lNaAc(pH5.2):50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸調(diào)pH至5.2，加水定容至100ml，分裝后高壓滅菌，儲存于4℃冰箱。
 

　　6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱。
 

　　7、溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋)，1%SDS。
 

　　8、溶液Ⅲ:5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為:K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
 

　　9、RNA酶A母液:將RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20℃。
 

　　10、飽和酚:市售酚中含有醌等氧化物，這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)，應(yīng)在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑)，并用等體積的0.5mol/LTris·Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH值達(dá)到7.6以上，因為酸性條件下DNA會分配于有機相。
 

　　11、氯仿:按氯仿:異戊醇=24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積=1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應(yīng)戴手套。
 

　　12、TE緩沖液:10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。
 

　　13、STET:0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，5%TritonX-100。
 

　　14、STE:0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。
 

　　15、電泳所用試劑:⑴TBE緩沖液(5×):稱取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。⑵上樣緩沖液(6×):0.25%溴酚藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液。